真菌基因組DNA提取試劑盒（目錄號：RTG2407）
● 試劑盒內容及保存：
|
試劑盒組成
|
RTG2407
（50次）
|
貯存方式
|
|
緩沖液C1
|
40 ml
|
常溫
|
|
緩沖液C2
|
12 ml
|
常溫
|
|
緩沖液C3
|
20 ml
|
常溫
|
|
漂洗緩沖液WB1
|
30 ml
|
常溫
|
|
DNA Wash
Buffer (濃縮液)
|
13 ml
|
常溫
|
|
洗脫緩沖液EB
|
15 ml
|
常溫
|
|
RNaseA
|
220 μl
|
-20℃
|
|
吸附柱CG
|
50個
|
常溫
|
|
收集管（2
ml）
|
50個
|
常溫
|
|
說明書
|
1份
|
|
● 儲存條件和效期：
室溫保存，24個月內有效。Buffer C2于Buffer C3可能有沉淀產生，37℃水浴溶解后即可。RNase A常溫運輸,-20℃保存。
● 產品簡介：
該試劑盒采用簡便的硅膠柱結合純化方式和獨特的溶液處理系統(tǒng)，可在60分鐘內可處理多個100mg新鮮或30mg干燥真菌組織樣品。獨特的緩沖液與硅膠柱可以有效的去除組織裂解物種的多糖，酚類，以及酶抑制物。該試劑盒提取到的DNA可以用于PCR，Southern雜交，酶切消化等實驗。無需使用酚氯仿等有機，可以同時進行多個樣品的處理。
● 準備工作：
1. 準備65℃水浴；無水乙醇；異丙醇；制冰機；1.5ml離心管；2ml離心管
2. 按照標簽所示在漂洗緩沖液PW中加入無水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?
3. 每次使用前請檢查緩沖液R2，緩沖液R3是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。
● 標準操作步驟：
如非指出，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。
1.樣品的處理：
A．新鮮樣品：新鮮樣品可以用液氮研磨成粉末?；蛘咴?5℃烘箱下過夜來干燥后按干燥樣品進行操作。
B．干燥樣品：用研缽或研磨研杵研磨成粉末。
2. 小于100mg新鮮樣品或者小于20mg干燥樣品，加入600μl Buffer C1及4μl
RNase A渦旋混勻。
3.65℃水浴10分鐘。孵育過程中短暫渦旋管子幾次。
4. 加入150μl Buffer C2，顛倒振蕩混勻,冰上放置1分鐘后10,000×g下離心3min。 （離心后應分層，如還有漂浮物，請延長離心時間）。
5. 小心地把上清液吸至另一新的小離心管中。注意確保不要打散沉淀團或把組織碎片也一起轉移。
6. 加入二分之一上清體積的 Buffer C3與與等體積的無水乙醇，充分混勻。如：向300μl
上清中加入150μl Buffer C3與300μl無水乙醇。
7. 把上述混勻的液體轉移到分離柱上。10,000×g離心1
min以結合DNA，棄去濾出液體。純化柱最大容量為750μl,如果混合液大于750μl,請分兩次過柱。
8. 將GBC吸附柱重新套回收集管中，加入600μl
DNA Wash Buffer（使用前須按要求用無水乙醇稀釋）至柱子中，10,000×g離心1min,倒棄流出液；
9.再加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g離心1min,棄去流出液；
10. 將吸附柱重新套回2ml收集管中，最大轉速（>13.000xg）離心空結合柱1min以干燥柱子的基質；這一步對下面的洗脫步驟至關重要。
12. 將柱子置于1.5ml滅菌離心管，加入50-150μl65℃預熱的T洗脫緩沖液EB至柱子的膜中央。室溫靜置5min；
13. 室溫下，離心(>13000g)1min，以洗脫DNA。保留含DNA的流出液。將DNA儲于-20℃。
對低DNA含量的樣品按如下操作：
1. 收集研磨成粉末的植物組織，新鮮組織約400mg（干燥組織約200mg），置樣品于15ml離心管中。
2. 加入9ml Buffer C1，劇烈地漩渦振蕩。
3.65℃水浴30-60min。水浴期間顛倒樣品數(shù)次。
4. 加入2.5ml Buffer C2，充分混勻，3000×g離心10分鐘。轉移上清到新的15ml離心管中，加入0.7倍的異丙醇，3000×g離心10分鐘。
5. 倒掉上清，加入300μl的滅菌去離子水與5μl RNaseA。65℃水浴溶解DNA。
6. DNA完全溶解后，加入150μl Buffer C3與300μl無水乙醇。
7. 按標準操作步驟的第七步，繼續(xù)往下操作。
● DNA濃度及純度檢測：
基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。可配制0.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應在23kb以上。使用分光光度計檢測時， OD260/OD280比值應為1.7–1.9之間，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。
|
常見問題
|
可能原因
|
建議
|
|
堵柱子
|
轉移裂解上清時，轉移了沉淀
|
按說明書操作，氯仿分離后，確保不轉移到沉淀
|
|
樣品太粘稠
|
樣品量別超過說明書上所說的，或者增加 Buffer C1 的用量。
|
|
低濃度的DNA量
|
樣品的破壁方式不對
|
不論新鮮還是干燥樣品，在加入 Buffer C1 之前必須用適當方式的研磨成粉末。
|
|
樣品的裂解效果不好
|
減少樣品量，或者增加Buffer C1的用量。
|
|
DNA殘留在柱子上
|
增加洗脫液的用量，并在離心洗脫前65℃孵育5min。
|
|
DNA洗滌不當
|
DNA
Wash Buffer按說明書用無水乙醇稀釋。
|
|
下游應用不好
|
提取的DNA含鹽量高
|
DNA
Wash Buffer如果必須按要求用無水乙醇稀釋，必須室溫放置。
|
|
提取的DNA含有乙醇
|
洗脫前，必須最高轉速空甩柱
子1min。
|
● 常見問題分析：
|
常見問題
|
可能原因
|
建議
|
|
沒有洗脫出DNA
|
加入緩沖液R5后沒有加入無水乙醇
|
樣品過柱前，必須用無水乙醇調整核酸結合條件，否則核酸不能掛柱。
|
|
漂洗緩沖液WB2中沒有加入乙醇
|
漂洗緩沖液WB2使用前請按照標簽加入無水乙醇。無水乙醇加入量不正確會導致核酸提取量大大降低。
|
|
低濃度的DNA量
|
緩沖液R2使用過量
|
按照步驟1加入適量緩沖液R2
|
|
洗脫體積太小
|
洗脫體積不能低于50μl，如洗脫體積太小，回收率將大大降低。
|
|
洗滌不恰當
|
漂洗緩沖液PW使用前請按照標簽加入無水乙醇。無水乙醇加入量不正確會導致核酸提取量大大降低。
|
|
低A260/A280比率
|
蛋白污染
|
不要忽略步驟8中用漂洗緩沖液WB1沖洗吸附柱
|
|
洗脫液pH值不合適
|
確保使用的洗脫液pH在8.0以上，如低于8.0將導致DNA洗脫量過低。
|
|
下游應用不好
|
提取的DNA含鹽量高
|
漂洗緩沖液WB2使用前請按照標簽加入無水乙醇。
|
|
提取的DNA含有乙醇
|
步驟11空甩柱子2分鐘非常關鍵，徹底去除漂洗液中的乙醇。
|
|
抑制PCR反應
|
增加緩沖液R2用量，徹底去除腐殖酸等PCR抑制因子；步驟4中確保不要吸取到沉淀。
|
RTG2407 真菌基因組DNA提取試劑盒發(fā)表文章
1. [2021 IF=6.064] Genome resequencing and transcriptome
analysis reveal the molecular mechanism of albinism in Cordyceps militaris.
Author: Ying Zhao, YuDong Liu, Xun Chen and Jun
Xiao
Product: RTG2407 真菌基因組DNA提取試劑盒
Journal: Fronties in
Microbiology. Published 11 April 2023
Institution： Institute of Edible Fungi, Liaoning
Academy of Agricultural Sciences
Paper link：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1153153/full