全血基因組DNA小量提取試劑盒
Total DLood DNA Miniprep
Kit
● 試劑盒內(nèi)容及保存：
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試劑盒組成
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RTG2406
（50次）
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貯存方式
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緩沖液DL1
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16
ml
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常溫
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緩沖液DL2
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16
ml
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常溫
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去蛋白液GD（濃縮液）
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30 ml
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常溫
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漂洗液PW（濃縮液）
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25
ml
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常溫
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洗脫緩沖液EB
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15
ml
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常溫
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吸附柱CG
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50個(gè)
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常溫
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收集管（2
ml）
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50個(gè)
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常溫
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說(shuō)明書(shū)
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1份
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● 儲(chǔ)存條件和效期：
該試劑盒常溫貯存，常溫運(yùn)輸。開(kāi)封后有效期一年。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
全血基因組DNA
小量提取試劑盒可從200-400 μl體積新鮮、冷凍或抗凝全血樣本中快速分離純化基因組DNA。該試劑盒可以在30分鐘內(nèi)完成單個(gè)或多個(gè)樣品的操作。 提取過(guò)程無(wú)需使用蛋白酶K消化，不需要酚氯仿抽提，
也無(wú)需耗時(shí)的異丙醇沉淀等過(guò)程 。
使用該試劑盒提取到的DNA
可以用于PCR，Southern雜交，酶切消化等實(shí)驗(yàn)。
● 準(zhǔn)備工作：
1. 準(zhǔn)備無(wú)水乙醇；制冰機(jī)；1.5ml離心管；2ml離心管；離心機(jī)
2. 按照標(biāo)簽所示在去蛋白液GD和漂洗液PW中加入無(wú)水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后常溫貯存?zhèn)溆谩?
3. 每次使用前請(qǐng)檢查緩沖液DL1和DL2是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。
● 標(biāo)準(zhǔn)操作步驟：
如非指出，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在常溫下離心。
注意：以下方案適用于400
μl體積新鮮或冷凍血液樣本。如果使用低于400 μl的全血樣本，必須按比例減少緩沖液DL1和DL2的用量或者用1×PBS溶液補(bǔ)齊至400 μl，嚴(yán)格按照緩沖液DL1：全血：緩沖液DL2=3：4：3體積比進(jìn)行操作，否則將導(dǎo)致后續(xù)操作無(wú)法進(jìn)行。
1. 加入300μl緩沖液DL1于1.5
ml離心管中。
2. 加入400
μl抗凝全血，漩渦劇烈震蕩30秒。 注：如果低于400 μl血液，用1×PBS補(bǔ)齊到400
μl。
3. 加入300μl緩沖液DL2，劇烈搖動(dòng)離心管3-5次，漩渦劇烈震蕩30秒-60秒。
注：加入緩沖液DL2后，會(huì)出現(xiàn)大量血紅蛋白沉淀，必須劇烈震蕩。
4. 12000 rpm 離心2分鐘。
5. 把吸附柱裝在2ml收集管中（已提供），將第4步得到的上清溶液全部轉(zhuǎn)入柱中（小心別觸及沉淀），12000
rpm離心1min，倒棄流出液重新套上收集管。
注：吸附柱的承受最大體積是700 μl，如上清超過(guò)此體積，可分2次離心，保證所有上清都加到柱中。
6.加入500 μl
去蛋白液GB（注意是否已經(jīng)加入乙醇）至柱子中，12000 rpm離心1min，棄去流出液。
注：吸附柱膜上會(huì)有血色素殘余，這是正?，F(xiàn)象，可以被去蛋白液GD和漂洗液PW洗去。
7. 將吸附柱重新套回2ml收集管中，加入700μl 漂洗液PW（注意是否已經(jīng)加入乙醇）至柱子中，12000 rpm離心1min,倒棄流出液；
8. 再加入500μl
漂洗液PW至柱子中，12000 rpm離心1min,
棄去流出液；
9. 將吸附柱重新套回2ml收集管中，12000 rpm離心空結(jié)合柱2 min以干燥柱子的基質(zhì)；
注：這一步驟至關(guān)重要，不要省略。 否則殘余乙醇會(huì)影響后續(xù)酶切或PCR實(shí)驗(yàn)。
10. 將柱子置于1.5ml滅菌離心管，加入50-80 μl65℃預(yù)熱的洗脫緩沖液EB或滅菌去離子水至柱子的膜中央。 常溫靜置2 min；
注： ① 洗脫緩沖液體積最好不少于50 μl，體積過(guò)小影響回收效率。
② 洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。
11. 12000 rpm離心
2 min洗脫DNA。保留含DNA的流出液。將DNA儲(chǔ)于-20℃。
● DNA濃度及純度檢測(cè)：
基因組DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。可配制0.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應(yīng)在23kb以上。使用分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)， OD260/OD280比值應(yīng)為1.7–1.9之間，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。
● 常見(jiàn)問(wèn)題分析：
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常見(jiàn)問(wèn)題
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可能原因
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建議
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堵柱子
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樣本體積不對(duì)，裂解不完全
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未按照說(shuō)明書(shū)使用指定體積操作，請(qǐng)嚴(yán)格按照緩沖液DL1：全血：緩沖液DL2=3：4：3體積比進(jìn)行操作
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回收不到DNA或得率低
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堵柱子
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見(jiàn)上
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化療病人全血中提取DNA
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化療病人血液中白細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致DNA數(shù)量降低
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全血樣品保存不當(dāng)，導(dǎo)致全血溶血導(dǎo)致DNA降解
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4℃冰箱中貯存2周的全血開(kāi)始出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，此時(shí)DNA隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)程序分解，最終導(dǎo)致分離不到電泳可見(jiàn)的DNA；全血應(yīng)該-20℃或-80℃貯存。
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去蛋白液GD和漂洗液PW沒(méi)有按說(shuō)明書(shū)加入乙醇稀釋
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使用前按說(shuō)明書(shū)加入適量的無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋
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DNA純度差
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高A260/A280比率接近2.0
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考慮全血樣品的新鮮程度。陳舊全血中的DNA會(huì)降解成小片段DNA或核苷酸混合物，導(dǎo)致A260讀數(shù)變大
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DNA中有RNA污染
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使用非常新鮮的全血提取DNA時(shí)電泳結(jié)果會(huì)有RNA污染，RNA不能作為擴(kuò)增模板，不會(huì)影響PCR擴(kuò)增。如要去除RNA，可在步驟1加入緩沖液DL1時(shí)同步加入5 μl RNaseA溶液（10mg/ml）
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洗滌時(shí)柱中有帶顏色的遺留物
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未按照說(shuō)明書(shū)使用指定體積操作
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請(qǐng)嚴(yán)格按照緩沖液DL1：全血：緩沖液DL2=3：4：3體積比進(jìn)行操作
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去蛋白液GB和漂洗液PW沒(méi)有按說(shuō)明書(shū)加入乙醇稀釋
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使用前按說(shuō)明書(shū)加入適量的無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋
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實(shí)驗(yàn)示例：
400μl human blood gDNA 上樣5μl
人血液基因組擴(kuò)增人β-球蛋白 1.3kb 片段