土壤基因組DNA提取試劑盒
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貨號(hào)
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產(chǎn)品名稱(chēng)
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規(guī)格
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RTG2403
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土壤基因組DNA提取試劑盒
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50次
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● 試劑盒內(nèi)容及保存：
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試劑盒組成
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RTG2403（50次）
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貯存方式
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緩沖液R1
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40
ml
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常溫
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緩沖液R2
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6
ml
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常溫
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緩沖液R3
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6 ml
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常溫
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緩沖液R4
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10
ml
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常溫
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緩沖液 R5（濃縮液）
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15
ml
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常溫
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漂洗緩沖液WB1（濃縮液）
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14
ml
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常溫
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漂洗緩沖液PW (濃縮液)
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13
ml
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常溫
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洗脫液EB
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15
ml
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常溫
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Glass
beads
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20 g
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常溫
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吸附柱CG
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50個(gè)
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常溫
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收集管（2
ml）
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50個(gè)
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常溫
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說(shuō)明書(shū)
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1份
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● 儲(chǔ)存條件和效期：
本試劑盒在室溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年。緩沖液R2和R3可能有沉淀產(chǎn)生，若溶液產(chǎn)生沉淀，應(yīng)在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
土壤樣品存在大量的抑制因子如腐殖酸、金屬離子等，而純化的DNA 中只要有這些微量物質(zhì)的存在，都會(huì)影響到PCR等酶促反應(yīng)。本公司的土壤試劑盒采用獨(dú)特的腐殖酸去除液（緩沖液R2）能夠有效去除腐殖酸；吸附柱CG能能有效去除金屬等抑制因子，提純得到的基因組DNA可直接用于PCR
反應(yīng)，酶切或定量實(shí)驗(yàn)。
● 準(zhǔn)備工作：
1. 準(zhǔn)備55℃，70℃水??；無(wú)水乙醇；異丙醇；制冰機(jī)；1.5ml離心管；2ml離心管
2. 按照標(biāo)簽所示在漂洗緩沖液WB1和漂洗緩沖液PW中加入無(wú)水乙醇；緩沖液R5中加入異丙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?
3. 每次使用前請(qǐng)檢查緩沖液R2，緩沖液R3是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。
● 標(biāo)準(zhǔn)操作步驟：
如非指出，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。
1. 稱(chēng)0.3-0.5 g土壤置于2ml離心管中，加入0.4gGlass Beads，再加入700 μl 緩沖液R1與100
μl 緩沖液R2。渦旋器高速震蕩3-5min。
注意：對(duì)含水量豐富的樣品，可以預(yù)先離心除去部分水分后再稱(chēng)取樣品。緩沖液R2是腐殖酸去除劑，100μl對(duì)大部分樣品來(lái)說(shuō)足以有效除去腐殖酸等抑制因子。對(duì)一些腐殖酸含量特別豐富的土壤， 緩沖液R2的量可以適當(dāng)增加，但不能超過(guò)250μl，否則會(huì)嚴(yán)重影響DNA的得率。
2. 加入100
μl 緩沖液R3（R3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用），渦旋混勻。70℃水浴處理10min。期間振蕩幾次。注意：如果要純化革蘭氏陽(yáng)性菌的DNA，請(qǐng)?jiān)?span>70℃處理完后，再90℃水浴處理2min。
3. 12000 rpm(~13,000g)離心1分鐘,取600μl上清到1.5ml離心管中，加入180 μl 緩沖液R4混勻。
注：轉(zhuǎn)移上清時(shí)確保不要吸取到沉淀，轉(zhuǎn)移的上清量最好不超過(guò)80%。
4. 冰上放置5分鐘。12000 rpm(~13,000g)離心1分鐘。
轉(zhuǎn)移上清到新的1.5ml離心管中。
注：轉(zhuǎn)移上清時(shí)確保不要吸取到沉淀，轉(zhuǎn)移的上清量最好不超過(guò)80%。
5. 加入與上清等體積的緩沖液R5（使用前請(qǐng)檢查是否已加入異丙醇），顛倒混勻。
6. 取750 μl混合液加到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm(~13,000g)離心30秒，倒掉濾出液。
7. 將剩余混合液加到吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12000rpm(~13,000g)離心30秒,倒掉濾過(guò)液。
8. 向吸附柱CG中加入500
μl 漂洗緩沖液WB1(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇),12,000
rpm (~13,000×g ) 離心30
秒，倒掉廢液。
9. 向吸附柱CG中加入600
μl 漂洗緩沖液PW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12,000
rpm (~13,000g) 離心30
秒，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。
10. 向吸附柱CG中加入600
μl漂洗緩沖液PW，12,000
rpm (~13,000g) 離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CG放入收集管中。
11. 12,000 rpm(~13,000g)離心2分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
注：此步驟非常重要，其目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。
12. 將吸附柱CG轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50–100
μl經(jīng)70℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，12,000 rpm(~13,000g)離心2分鐘。
注: = 1 \* GB3 ① 洗脫緩沖液體積最好不少于50 μl，體積過(guò)小影響回收效率。
= 2 \* GB3 ② 洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。
13.
DNA產(chǎn)物-20℃保存。
大量操作步驟（針對(duì)含微量核酸的樣品）
1. 稱(chēng)1-5
g土壤置于10ml離心管中，加入1gGlass Beads，再加入3ml
緩沖液R1與200μl
緩沖液R2。渦旋器高速震蕩3-5分鐘。
2.
加入600μl
緩沖液R3，渦旋混勻。70℃水浴處理10分鐘。期間振蕩幾次。
3.3000g離心3分鐘，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中，加入550μl
緩沖液R4混勻。
4.
冰上放置5分鐘。8000
g離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中。
5.
以下按標(biāo)準(zhǔn)操作步驟的第五步繼續(xù)操作。
● DNA濃度及純度檢測(cè)：
基因組DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度?？膳渲?.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應(yīng)在23kb以上。使用分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)， OD260/OD280比值應(yīng)為1.7–1.9之間，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。
● 常見(jiàn)問(wèn)題分析：
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常見(jiàn)問(wèn)題
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可能原因
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建議
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沒(méi)有洗脫出DNA
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緩沖液R5沒(méi)有加入異丙醇
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樣品過(guò)柱前，必須用異丙醇調(diào)整核酸結(jié)合條件，否則核酸不能掛柱。
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漂洗緩沖液PW中沒(méi)有加入乙醇
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漂洗緩沖液PW使用前請(qǐng)按照標(biāo)簽加入無(wú)水乙醇。無(wú)水乙醇加入量不正確會(huì)導(dǎo)致核酸提取量大大降低。
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低濃度的DNA量
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緩沖液R2使用過(guò)量
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按照步驟1加入適量緩沖液R2
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洗脫體積太小
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洗脫體積不能低于50μl，如洗脫體積太小，回收率將大大降低。
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洗滌不恰當(dāng)
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漂洗緩沖液PW使用前請(qǐng)按照標(biāo)簽加入無(wú)水乙醇。無(wú)水乙醇加入量不正確會(huì)導(dǎo)致核酸提取量大大降低。
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低A260/A280比率
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蛋白污染
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不要忽略步驟8中用漂洗緩沖液WB1沖洗吸附柱
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洗脫液pH值不合適
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確保使用的洗脫液pH在8.0以上，如低于8.0將導(dǎo)致DNA洗脫量過(guò)低。
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下游應(yīng)用不好
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提取的DNA含鹽量高
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漂洗緩沖液PW使用前請(qǐng)按照標(biāo)簽加入無(wú)水乙醇。
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提取的DNA含有乙醇
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步驟11空甩柱子2分鐘非常關(guān)鍵，徹底去除漂洗液中的乙醇。
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抑制PCR反應(yīng)
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增加緩沖液R2用量，徹底去除腐殖酸等PCR抑制因子；步驟4中確保不要吸取到沉淀。
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實(shí)驗(yàn)示例：
Buffer R2去除腐殖酸效果對(duì)比圖
左圖-步驟1提取時(shí)使用了Brffer R2，顏色明顯淺很多(左1,左2)，
說(shuō)明Buffer R2對(duì)去除腐殖酸、色素等效果明顯
右圖-步驟3上清加入Buffer R4進(jìn)一步處理，離心去除雜質(zhì)，
裂解時(shí)加有Buffer R2的，再經(jīng)Buffer R4處理幾乎不再有顏色(右1,右2)，
而不加Buffer R2的顏色還很深(右3，右4)。
1, 2: SDS高鹽酚氯仿抽提法
3, 4: 土壤基因組DNA提取試劑盒(RTG2403)提取
1, 3: 為花基土壤
2, 4: 河邊淤泥