BN電泳樣品制備試劑盒（動(dòng)物組織樣品） Ver260180-1.0
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產(chǎn)品編號(hào)
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產(chǎn)品名稱
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規(guī)格
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RTD8304
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BN電泳樣品制備試劑盒（動(dòng)物組織樣品）
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50次
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● 產(chǎn)品包裝：
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貨號(hào)
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組份
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規(guī)格
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貯存
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RTD8304-01
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裂解緩沖液
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50 ml
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-20℃
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RTD8304-02
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重懸緩沖液
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20 ml
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-20℃
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RTT2106-02
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Benzonase（250
U/μl）
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0.25 ml
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-20℃
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DM1080S
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10%DDM
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5 ml
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-20℃
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PL131-01
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2×膜蛋白A型上樣緩沖液
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1 ml
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-20℃
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PL124-01
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2×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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1 ml
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-20℃
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BC270-1ml
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2% G-250染料
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1 ml
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4℃
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說明書
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一份
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● 產(chǎn)品簡介：
Blue
Native PAGE（BN -PAGE）是一種從生物樣品（質(zhì)膜，胞漿等）中分離分子量10 kD-10 M kD 范圍的蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳技術(shù)，其原理是用溫和去污劑(如 DDM，digitonin)將蛋白復(fù)合體從生物膜中以近似天然的狀態(tài)分離出來，使用考馬斯亮藍(lán) G-250 代替 SDS與蛋白結(jié)合而使其帶負(fù)電荷，根據(jù)蛋白分子量不同在 PAGE膠中得到分離，由于考馬斯亮藍(lán)G-250存在，使蛋白都覆蓋上負(fù)電荷，可以分離堿性蛋白（pI＞7）和酸性蛋白（pI＜7）。
該產(chǎn)品含有BN電泳樣品制備及電泳上樣所需的試劑，可以在約90分鐘內(nèi)完成動(dòng)物組織樣品中胞漿蛋白和膜蛋白的提取。提取原理：動(dòng)物組織在裂解緩沖液中勻漿處理得到細(xì)胞懸液，離心分離得到上清和沉淀；上清為胞漿蛋白，沉淀為細(xì)胞核，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，未裂解的細(xì)胞碎片等；隨后用溫和去垢劑增溶沉淀，離心后提取增溶后的蛋白（主要包含質(zhì)膜蛋白，細(xì)胞器膜蛋白，核膜蛋白）；提取的蛋白適用于蛋白多聚體分析，酶活測定以及WB檢測等。
該產(chǎn)品不建議用于細(xì)胞BN樣品的制備，細(xì)胞BN樣品的制備可選擇貨號(hào)：RTD8305。
以每次處理100 mg動(dòng)物組織樣品計(jì)算，該試劑盒可以使用50次。
● 保存、效期及運(yùn)輸：
-20℃保存，有效期一年，濕冰運(yùn)輸。
● 使用說明：
自備材料：
1×PBS；1
ml玻璃勻漿器；臺(tái)盼藍(lán)染色液；蛋白酶抑制劑；磷酸酶抑制劑；剪刀或刀片； BCA蛋白定量試劑盒；冰??；低溫離心機(jī)。
一. 用前必讀：
1. 離心機(jī)請(qǐng)調(diào)整成RCF/g模式，按照離心力設(shè)置離心機(jī)（不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置），所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機(jī)中進(jìn)行。
2. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑如100
mM PMSF（100×）（自備，試劑盒不提供），添加時(shí)按照1:100添加。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）。
3. 蛋白定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號(hào)：RTP7102）。
流程圖：
二. 提取步驟：
2.1 組織漂洗：
取約100 mg新鮮動(dòng)物組織，用1×PBS清洗兩次，棄凈清洗液。
2.2 組織勻漿（關(guān)鍵步驟）：
用剪刀或刀片盡量小心剪切成細(xì)小的組織碎片，置于1.5 ml離心管中，先加入0.5
ml裂解液，隨后轉(zhuǎn)移到1
ml玻璃勻漿器內(nèi)冰浴充分勻漿~5次；隨后再補(bǔ)加入0.5
ml 裂解液冰浴繼續(xù)勻漿~5次，每100 mg組織總共需要使用1 ml裂解緩沖液。
注：此勻漿步驟為關(guān)鍵環(huán)節(jié)。玻璃勻漿器（緊致型）上下推拉一次為一次完整勻漿，勻漿本著寧少勿多，不夠再補(bǔ)的原則，不要過度勻漿。勻漿破碎效果與組織類型有關(guān)，不同的樣品所需勻漿次數(shù)不同，軟組織如肺，脾臟，腎臟，腦等需要10次左右，硬組織如心臟，骨骼肌等需要15次左右。鑒定方法：取10
μl勻漿后的樣品，加入等體積的臺(tái)盼藍(lán)溶液，混勻，在顯微鏡下觀察臺(tái)盼藍(lán)溶液染色陽性（藍(lán)色）細(xì)胞數(shù)目的比例，當(dāng)陽性（藍(lán)色）細(xì)胞破碎達(dá)到80%即可停止勻漿，請(qǐng)勿過度勻漿。若陽性（藍(lán)色）細(xì)胞比例未達(dá)到80%，適當(dāng)增加1-2次勻漿，隨后按照同樣的方法使用臺(tái)盼藍(lán)溶液進(jìn)行鑒定。
2.3 胞漿蛋白提?。?/b>
2.3.1把勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5
ml離心管內(nèi)，冰浴放置15分鐘（間歇混勻）或者4℃旋轉(zhuǎn)混勻15 分鐘；
2.3.2
16000 g 4℃離心10分鐘，取80%上清保存?zhèn)溆茫?
注：上清主要包含胞漿蛋白。吸取上清時(shí)不要觸及沉淀，可以只取80%體積上清，避免和沉淀交叉污染。100
mg組織得到的胞漿蛋白濃度約2-5
μg/μl，不同組織略有不同。
2.4 沉淀樣品制備：
2.4.1
徹底去除步驟2.3.2中的上清，100
mg組織得到的沉淀中加入0.5
ml重懸緩沖液，吸頭重懸沉淀。注：重懸沉淀時(shí)，溶液可能會(huì)變粘稠，會(huì)有堵吸頭現(xiàn)象，經(jīng)過2.4.2步驟處理后再次重懸。
2.4.2
蛋白溶液中加入5 μl
（1/100溶液體積）Benzonase，常溫20
min，間歇混勻；
注：加入核酸酶處理能有效降低溶液粘度，提高蛋白得率；此步驟需要常溫進(jìn)行，如低溫孵育，需延長時(shí)間到40
min。
2.4.3 關(guān)鍵步驟-定量沉淀樣品濃度：
BCA方法測定蛋白溶液的蛋白濃度（貨號(hào)：RTP7102）；
注：必須測定蛋白濃度后再進(jìn)行如下操作，不能根據(jù)經(jīng)驗(yàn)估算蛋白濃度。
100
mg組織得到沉淀重懸于0.5
ml緩沖液中，蛋白濃度約5-10
μg/μl，不同組織略有不同；
2.4.4 用重懸緩沖液調(diào)整蛋白濃度為1
μg/μl。
注：溶液可以按需分裝，建議每管50-100 μl，-80℃保存待用；
2.4.5關(guān)鍵步驟-沉淀樣品增溶：
取合適體積的蛋白溶液（濃度1 μg/μl），加入1/10體積
10% DDM，輕柔混勻，冰浴30分鐘（間歇混勻）或者4℃旋轉(zhuǎn)混勻30 min。如取50 μl蛋白溶液（濃度1 μg/μl），加5 μl 10%DDM。
注：此步驟是把沉淀（包含細(xì)胞核，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及細(xì)胞碎片）中的蛋白（包括膜蛋白）用去垢劑溶解出來，由于去垢劑溶解能力需要和蛋白含量嚴(yán)格對(duì)應(yīng)，故加入溶液體積要精準(zhǔn)，不能隨意變更。
2.4.6
16000 g 4℃離心15分鐘，取上清至一干凈1.5 ml離心管中即為增溶后蛋白溶液（小心不要吸取沉淀），此時(shí)得到的蛋白濃度為1
μg/μl，其中去垢劑DDM終濃度為1%。
三. BN電泳上樣液制備：
3.1
胞漿蛋白：
由于胞漿蛋白不含有去垢劑，按照蛋白含量的1/5（質(zhì)量比）添加考馬斯亮藍(lán)G-250染料后進(jìn)行電泳。舉例說明：配制100
μl 濃度1 μg/μl的胞漿BN上樣液，內(nèi)含蛋白100
μg，需要添加20
μg G-250，即添加1 μl 2% G-250。
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100 μl（1μg/μl）胞漿蛋白上樣液
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胞漿樣品
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100 μg
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2×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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50 μl
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2% G-250
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1 μl
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水
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補(bǔ)至 100 μl
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不要加熱，上樣5-20 μl（5-20 μg）
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3.2
沉淀樣品：
步驟2.4.6蛋白溶液中加入等體積2×膜蛋白A型上樣緩沖液（貨號(hào)：PL131-01），此時(shí)蛋白濃度為0.5
μg/μl，不要加熱，上樣5-20
μg。
四. BN電泳凝膠選擇：
BN電泳可以選用Blue/Clear
非變性凝膠電泳試劑盒(預(yù)制膠，通用型)（貨號(hào)：RTD6139）或Blue/Clear
非變性凝膠電泳試劑盒（手灌膠）（貨號(hào)：RTD6140）；轉(zhuǎn)膜緩沖液選擇10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號(hào)：BC600P）；蛋白Marker可以使用寬分子量非變性電泳蛋白質(zhì)Marker
II（21-880
kD）（貨號(hào)：RTD6136）。
五. 實(shí)驗(yàn)示例：
小鼠組織和Jurkat細(xì)胞 BN樣品制備電泳圖
凝膠：3-12% RealPAGE Native BN/CN 預(yù)制膠（RTD6138-0312）；
樣品提取：50 mg 凍存小鼠組織，加0.5 ml裂解緩沖液，勻漿10次；四度旋轉(zhuǎn)10min；
16000g 15 min，上清為胞漿蛋白，BCA定量濃度為8 μg/μl；
沉淀中加0.2 ml重懸緩沖液；加入2 μl Benzonase（250U/μl），RT 20 min；
BCA 定量，濃度15 μg/μl，用重懸緩沖液稀釋為1 μg/μl；
沉淀樣品增溶：取100 μl 重懸蛋白（1μg/μl）+10 μl 10%DDM，四度旋轉(zhuǎn)30min；
16000g 15min，取上清即為增溶后的沉淀樣品。
上清樣品上樣處理：上樣液體積100μl（濃度1μg/μl），包含100μg 蛋白（12.5 μl），50 μl
2×BN/CN上樣緩沖液，1μl 2%G-250；上樣10μl/10μg；
沉淀樣品上樣處理：上樣液體積100μl（濃度0.5 μg/μl），取50 μl增溶后的上清加
50 μl PL124，上樣10 μl/5μg和20 μl/μg